DLG e.V. - Mikrobiologische Schnelltests werden immer wichtiger

Mikrobiologische Schnelltests werden immer wichtiger

aus DLG-Lebensmittel Ausgabe 5/2017

Hinter den meisten lebensmittelbedingten Erkrankungen stecken mikrobielle Ursachen. Im Zentrum der europäischen Diskussion um eine Risikominimierung stehen Campylobacter-Infektionen und Trichinellosen. Aber auch Salmonellen, Listerien und coliforme Bakterien bereiten nach wie vor immer wieder Probleme. Schnelltests können bei der Ursachenfindung und Schadensbegrenzung helfen – im Sinne des Verbraucherschutzes und der Lebensmittelhersteller.

Ist das Hackfleisch tatsächlich noch frisch? Diese Frage soll das neue mobile Analysegerät BFD-100 von fresh­detect schnell und direkt vor Ort beantworten können. Das Scanner-ähnliche Gerät wird einfach ein paar Sekunden lang auf das Fleisch gedrückt und zeigt kurz darauf die Gesamtkeimzahl an. Die Messung beruht darauf, dass die mit Blaulicht bestrahlte Probe durch Fleischporphyrine fluoresziert. Das Licht wird von einem integrierten Spektrometer erfasst und über bestimmte Algorithmen aus Messwerten der hinterlegten Datenbank in die korrelierende Menge an Keimen übersetzt. Um diese und andere aktuelle Entwicklungen im Bereich mikrobiologischer Schnelltests ging es beim diesjährigen Mikrobiologie-Symposium der Hochschule Ostwestfalen-Lippe in Lemgo. Die Veranstaltung präsentierte sich als gelungene, praxisbezogene Kombination aus Fachvorträgen und Industriemesse. Und sie machte deutlich, dass sich „schnell“ auf drei Aspekte beziehen kann: Probenvorbereitung und Materialien, Untersuchungsmethoden und Geräte sowie Auswertung und Software.

Solide Daten zur Situation bilden die Grundlage für gezielte und rechtzeitige Maßnahmen, um mikrobielle Probleme in den Griff zu bekommen. Im einleitenden Vortrag über staatliche Monitoring-Programme verwies Rolf Kamphausen vom Verbraucherschutzministerium NRW darauf, dass in Zukunft neben tierischen Lebensmitteln vermehrt auch pflanzliche Produkte berücksichtigt werden sollen. Generell gelte es außerdem, möglichst schon bei der Primärproduktion anzusetzen und Prozesse zu kontrollieren.

Spätblähungen vorbeugen mit dem Sy-Lab AMP-6000® zum Nachweis von Clostridium tyrobutyricum, Cl. butyricum, Cl. sporogenes und Cl. beijerinkii. Pro Durchgang können bis zu 8 Proben für die Untersuchung auf einen Parameter oder 4 Proben für je 2 Parameter abgearbeitet werden.

Neue Testmethoden mit breitem Anwendungspotenzial

Gerätehersteller, Lebensmittelindustrie und Wissenschaftler sind hier bereits auf gutem Weg. Stichwort Clostridien in Milch. Bereits wenige Endosporen können bei Hartkäse während der Reifung sensorische Veränderungen, wie Fehlaromen, unregelmäßige Lochung oder Risse verursachen und so zu hohen Verlusten führen. Durch eine Quantifizierung von Clostridiensporen bereits in der Anlieferungsmilch könnten Molkereien das Risiko besser einschätzen. Da die Ursache meist auf einer fäkalen Verunreinigung beruht, hätte man zudem einen geeigneten Parameter zur Kontrolle der Stallhygiene. Johanna Brändle, BOKU Wien, stellte in diesem Zusammenhang eine Methode vor, die sich als objektive Alternative zum zeitaufwendigen, wenig spezifischen und relativ unempfindlichen MPN-Verfahren (most probable number) anbietet. Dazu nutzte ihre Arbeitsgruppe das neue Sy-Lab-System AMP-6000 zur Keimzahlbestimmung, wobei die anaerobe Inkubation der Milch zur Anreicherung wesentlich weniger Tage in Anspruch nahm. Bei einer automatischen Herstellung der Verdünnungsreihen und gleichzeitigen Untersuchung von bis zu 32 Replikaten pro Verdünnung, sei die Präzision des statistischen Verfahrens vergleichbar mit der Direktzählung, bilanzierte Brändle. Das System, das einen Farbumschlag in einem optimierten chromogenen Nährmedium misst, sei mit einer Nachweisgrenze von 75 Sporen pro Liter Milch bzw. 30 bei Deepwellplatten rund sechsmal empfindlicher als die übliche Methode. Scan und Bewertung dauerten gerade mal eine Minute pro Probe.

Pathogene und Verderbnis­erreger frühzeitig aufspüren

Salmonellen, Listerien und E. coli O157:H7 auf Schweineschlachtkörpern und Fleischprodukten gehören zu den Pathogenen und führen immer wieder zu Krankheitsausbrüchen. Silvia Bonardi von der Universität Parma hob in ihrem Vortrag hervor, dass geeignete Prozesshygiene das Risiko von Kontaminationen deutlich senkt. Wenn ein Betrieb Pathogene bereits am Schlachtkörper identifizieren könnte, ließen sich zeitnah Desinfektionsmaßnahmen einleiten. Sie schilderte ihre Erfahrungen mit dem 3M Molecular Detection System (MDS): Das System basiert auf isothermischer DNA-Amplifikation, wobei die Verwendung von mehreren spezifischen Primern für eine hohe Genauigkeit sorgt. Die Reaktionsprodukte werden anschließend in Echtzeit über Biolumineszenz gemessen. Das Prozedere sei sehr bedienerfreundlich, ergänzte Bonardi. Die über Nacht angereicherten Proben würden in vorgefüllten Röhrchen lysiert, in ebenfalls fertige Reagenzgefäße gegeben und diese in das MDS eingesetzt. Den Rest übernehme das Gerät beziehungsweise die per USB angeschlossene Software. Bei einem Besuch der Ausstellermesse, wo neben Sy-Lab und anderen auch 3M einen Stand hatte, waren weitere Details zu erfahren. Etwa, dass man pro Durchlauf nicht nur bis zu 96 Proben, sondern pro Platz jeweils auch auf vier verschiedene Organismen testen kann. Oder dass der Nachweis von Salmonellen insgesamt eine Stunde dauert, ein positiver Befund jedoch schon nach etwa 15 Minuten auf dem Monitor erscheint. Die Software kann gleichzeitig vier Geräte steuern und die Ergebnisse interpretieren.

Exemplarisch für pflanzliche Lebensmittelgruppen lassen sich ready-to-eat-Salate nennen. Blattsalate weisen dabei schon natürlicherweise eine größere Besiedlung mit Bakterien auf, wobei es sich oft um ungefährliche Laktobazillen handelt. Manchmal siedeln sich aber auch Verderbniserreger wie Pseudomonas oder Pathogene wie EHEC an. Zusätzlich können mit dem Gieß- und dem Prozesswasser Keime übertragen werden, beispielsweise indem durch belastetes recyceltes Waschwasser eine Kreuzkontamination auf unbelastete Salatherzen oder über Schnittkanten ins Blattinnere erfolgt. Agnes Weiß von der Universität Hohenheim ging in ihrer Präsentation darauf ein, inwieweit bestimmte antimikrobielle Zusätze zum Waschwasser dessen Reinigungswirkung verbessern könnten. Zum Einsatz kamen dabei Quillaja-Extrakt (QSE) aus dem Seifenrindenbaum sowie das kationische Tensid Nα-Lauroyl-L-Arginin-Ethylester (LAE, E243). Die Keimzahluntersuchung auf den Salaten im Verlauf der Kühllagerung und die des Prozesswassers zeigte, dass QSE die mikrobielle Belastung in beiden Fällen weniger deutlich als LAE verringert. Andererseits ließ sich die Wirkung durch eine Erwärmung des Wassers auf 45 °C erhöhen, was aber bei LAE zu starken sensorischen Einbußen bei der Ware führte. Bei einer zweiten Fragestellung ging es darum, ob moderne kulturunabhängige und kulturabhängige Methoden dieselben Pseudomonas-Spezies detektieren und sich erstere daher als Alternative zur Analyse der Populationsstruktur eignen. Zur genaueren Identifizierung hatte Weiß die Ergebnisse mit Selektivagar-Kultur denen mit 16S rRNA Gen-Sequenzierung gegenübergestellt. Tatsächlich ergab sich eine gute Übereinstimmung.

Bakterien im Schnelldurchlauf gezählt

Trinkwasser gilt als wichtigstes Lebensmittel und ist für die Herstellung vieler Produkte unverzichtbar. Die Analytik seines mikrobiologischen Gesamtzustandes wird dadurch erschwert, dass sich nur ein Bruchteil der Wasserbakterien kultivieren lässt. Besser eignet sich dafür ebenso wie bei der Freigabeuntersuchung von Roh- und Trinkmilch die Durchflusszytometrie (DFZ). Bei der DFZ werden Zellen in einem Flüssigkeitsstrom hydrodynamisch fokussiert und durch den Mikrokanal einer Messküvette geführt. Mit Hilfe eines komplexen optischen Systems werden sie dort nicht nur automatisch gezählt, sondern auch „abgetastet“. So ermöglicht die Messung des Vorwärts- und des Seitwerts-Streulichtes Rückschlüsse auf die Größe und Granularität beziehungsweise Komplexität. Als DFZ-Expertin verwies Marija Zunabovic-Pichler von der BOKU Wien in ihren Ausführungen zu den Untersuchungen von realen Wasserproben auf eine praktische Erweiterungsmöglichkeit der Methode: Wenn man das Erbmaterial der Zellen zusätzlich mit einem fluorogenen Farbstoff wie DAPI oder Propidiumiodid markiert und mit einem Laserstrahl mit der Anregungswellenlänge belichtet, kann man sogar unterschiedliche Organismengruppen identifizieren. Die DFZ zeichne sich dadurch aus, dass sie robust, leicht durchführbar und schnell sei, fasste Zunabovic-Pichler zusammen. Dabei arbeite sie mit wenigen Millilitern, wobei eine einfache Messung der Gesamtkeimzahl nur wenige Minuten dauere und über 1.000 Zellen/sec analysiert würden. Andererseits machten Fotos von als Graphen, Plots oder Cluster dargestellten Ergebnissen den Wert einer guten Auswertesoftware deutlich.

Das Risiko verringern: Je früher aufgrund von Tests entsprechende Hinweise kommen, desto zeitiger können ein mögliches Qualitätsproblem in der Produktion korrigiert bzw. der Prozess oder die Auslieferung unterbrochen werden.

Schnellmethoden auch für Hefen und Pilze

Nicht nur Bakterien, sondern auch Hefen bereiten Lebensmittelherstellern häufig Probleme und stellen ein potenzielles Einsatzgebiet für mikrobiologische Schnelltests dar. Beispielsweise können sich osmotolerante Hefen in stark zuckerhaltigen Matrizes wie Honig oder Marzipan vermehren. Das entstehende CO2 führt unter Umständen zu sogenannten Bombagen oder zu optischen Mängeln. Diese Problematik griff Jens Pfannenbecker von der Hochschule OWL auf. Sein Team habe zunächst ein neues Kulturmedium entwickelt, das durch Zugabe von Nährstoffen wie Malzextrakt, Ammoniumsalzen und Pepton die Bebrütungszeit deutlich auf nur 48 Stunden verkürzt. Außerdem würde im Vergleich mit anderen Medien mehr und schneller Gas gebildet. Des Weiteren ging es um die Nachweismethode, wobei Pfannenbecker mit dem Biolumix TM (i&L Biosystems) arbeitete. Das mikrobielle Testsystem mit eingebautem Inkubator nutzt CO2 als universellen Marker für mikrobielles Wachstum. Die Teströhrchen wurden mit dem Spezialmedium gefüllt, die automatisierte Messung gestartet. Veränderungen der Sensoren werden in festen Zeitabständen photometrisch erfasst und in Echtzeit detektiert. Da die Sensorzone der Messzellen für Feststoffe und Flüssigkeiten undurchdringlich ist, wird das Ergebnis nicht durch die Probenmatrix verfälscht. In seiner positiven Bilanz hob Pfannenbecker neben der leichten Bedienung und der Datenarchivierung die Eignung auch bei geringen Keimzahlen hervor.

Viren als aktuelle Herausforderung

Bisher liegt der Fokus für die mikrobiologische Lebensmittelüberwachung auf Bakterien und Pilzen. Aktuell rücken vermehrt aber auch wieder Viren ins Blickfeld der deutschen Gesundheits- und Hygienedebatte. Reimar Johne vom Bundesinstitut für Risikoforschung nannte auf dem Symposium die Zunahme von Hepatitis E-Infektionen (HEV) als Beispiel. Der häufigste Übertragungsweg ist der Kontakt mit infizierten Schweinen und der Verzehr von daraus hergestellten Lebensmitteln. Während die Tiere generell keine Krankheitssymptome zeigen, können bei Menschen akute und chronische Leberentzündungen auftreten. Aktuelle Untersuchungen an 120 Realproben von Roh- und Leberwurst aus dem Lebensmittelhandel hätten in diesem Zusammenhang eine Nachweisrate von 20 Prozent (HEV-RNA) ergeben, sagte Johne. Jede fünfte Probe war also belastet. Zum Nachweis von Viren kommen in der Regel molekulare Methoden zum Einsatz, die an sich zumindest relativ schnell und inzwischen für unterschiedliche Matrizes validiert sind. Üblicherweise gliedert sich die Untersuchung in Homogenisierung der Probenmatrix, Extraktion der viralen Nukleinsäuren sowie Detektion spezifischer Nukleinsäuren mit Hilfe von reverser Transkription und real-time PCR. Bei positivem Nachweis wird üblicherweise eine Sequenzierung angeschlossen, um den HEV-Genotyp zu ermitteln, was allerdings den Zeit- und Kostenaufwand entsprechend erhöht. Johne machte darauf aufmerksam, dass eine Bewertung des Verbraucherrisikos allein anhand der PCR-Befunde schwierig sei. Daher sei das BfR dabei, eine Zellkulturmethode zur Ermittlung der Langzeit- und Hitzestabilität des Virus zu entwickeln und entsprechende Methoden zur HEV-Inaktivierung während der Herstellung der Lebensmittel zu etablieren.

Dietrich Made vom Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt nannte mit einer statisch validen Probennahme und einer vollständigen Extraktion zwei weitere Herausforderungen, die es bei der Analyse zu meistern gilt. Am Beispiel von Noroviren zeigte er, dass diese sich in Lebensmittelproben wie Erdbeeren und anderen Feldfrüchten meist sehr ungleichmäßig verteilen. Aus  einem Lot müsste daher eine an das Risiko angepasste Zahl an Teilproben entnommen und in ein eindimensionales System umgewandelt werden. In Punkto Extraktion sollten Anwender außerdem mit Hilfe eines zugesetzten Prozesskontrollvirus deren Effizienz bestimmen und im Bericht angeben.

Die „richtige“ Methode wählen

Die Vielzahl an methodischen Plattformen zur mikrobiologischen Analytik stellt inzwischen selber eine Herausforderung dar. Welche der vielen methodischen Plattformen eignet sich wofür am besten und für wen? Als Alternative oder Ergänzung zu klassischen kulturellen Methoden bieten sich neben optimierten kulturellen Schnellmethoden vor allem PCR (als molekularbiologische Methode) und ELISA (als immunologischer Test) an. Gegebenenfalls eignet sich zudem die FTIR-Spektroskopie mit Mikrotiterplatten und schneller Software zur Bestimmung des Metaboloms, das heißt der Summe aller charakteristischen Stoffwechseleigenschaften einer Zelle.

MALDI-TOF MS und Gesamtgenomsequenzierung (WGS) als sehr leistungsstarke Methoden erfordern dagegen ein entsprechendes Budget, ausgewiesene Expertise zur Interpretation der Ergebnisse und zudem eine exakte Probenvorbereitung. Bei der matrix-assisted-laser-desorption-ionisation time-of-flight Massenspek­trometrie wird das Proteom von Mikroorganismen und insofern der spezifische „Protein-Fußabdruck“ bestimmt. Unter anderem ist so eine schnelle und zuverlässige Differenzierung in pathogen/apathogen möglich. Die WGS, bei der alle charakteristischen DNA-Abschnitte simultan sequenziert und von der Software zum Gesamtgenom umgesetzt werden, ist mit einer Menge von Daten verbunden, die eine ausreichende Daten-Infrastruktur notwendig macht.



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